CRISPR_Cas9结合Cre-loxP技术制备溴结构域蛋白4基因敲除小鼠

摘要：

文题释义：

CRISPR/Cas9：是一种由小导向RNA介导的对靶基因定向编辑技术，可以快速、有效地修饰各种物种和细胞类型的内源基因。

Cre-loxP：Cre-loxP系统具有很高的组织特异性或空间特异性，在该系统的衍生系统中，Cre ERT-它莫昔芬系统在翻译后水平对Cre入核时间进行调控，具备优良的时间特异性，可以做到控制目的基因在何时、何处精确表达。

背景：目前CRISPR/Cas9结合Cre-loxP技术制备溴结构域蛋白4(bromodomain-containing protein 4，BRD4)基因敲除小鼠的实验方法非常少见。

目的：运用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠基因组中BRD4基因片段，构建BRD4基因敲除小鼠。

方法：根据BRD4基因的外显子序列，设计一段gRNA并合成。gRNA体外转录后和Cas9 mRNA以及含loxp位点的质粒共同注射入受精卵细胞中，Cas9通过识别gRNA先导链切割目的片段，然后loxp插入到切割位点，在与Cre配种后，Cre酶会切割loxp位点实现最终的特异性删除效果。注射后的受精卵细胞移植至C57BL/6N雌性小鼠获得子代小鼠，对子代小鼠进行测序鉴定其基因型。将成功导入loxp位点的小鼠BRD4-loxP+/-(F0代)与野生型C57BL/6N小鼠配繁后筛选可稳定遗传的小鼠BRD4-loxP+/-(F1代)，BRD4-loxP+/-小鼠一部分互相交配，一部分与CAGGCre-ERTM鼠交配，获得BRD4-loxP+/+小鼠和BRD4-loxP+/-、CAGGCre-ERTM共表达的小鼠(F2代)；F2代小鼠互相交配可以获得纯合子BRD4-loxP+/+、CAGGCre-ERTM小鼠。将6-8周纯合子小鼠腹腔注射它莫昔芬75 mg/kg(溶于玉米油中)，连续7 d即可完成BRD4基因的诱导敲除。取基因敲除后的小鼠尾部片段，吸附柱法提取DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测BRD4基因片段在小鼠尾部组织中的表达。

结果与结论：①通过PCR筛选鉴定出F1代小鼠7，8，9，10，12，14，16，19，20，21，25，42，43和47号小鼠为成功插入2条loxP片段等位基因的杂合型小鼠；②F2代交互繁育出的F3代纯合子用它莫昔芬诱导后，经PCR凝胶电泳验证表明纯合子小鼠中BRD4基因片段被成功敲除；③提示利用CRISPR/Cas9技术结合Cre-loxP技术成功构建出了BRD4基因敲除小鼠。

缩略语：溴结构域蛋白4：bromodomain-containing protein 4，BRD4

https://orcid.org/0000-0002-0792-4025 (王向宇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: CRISR/Cas9, Cre-loxP, BRD4, 基因敲除, 小鼠, 它莫昔芬

引用本文: 王向宇, 朱睿智, 赵志平, 张聿达, 张永涛, 王昌耀. CRISPR/Cas9结合Cre-loxP技术制备溴结构域蛋白4基因敲除小鼠[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(32): 5179-5184.

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